1.- INTRODUCCIÓN.
La micropropagación o Cultivo in vitro, es una técnica de
Normalmente, el material de partida utilizado en la
micropropagación de plantas ,está constituido por porciones apicales de brotes
en crecimiento activo, o bien yemas o
fragmentos de ápices meristemáticos. A estos
Incluso la célula más diminuta de una planta posee el
asombroso potencial de convertirse en una planta idéntica a su progenitora, si
se dan las condiciones adecuadas. Cualquier célula de una raíz, hoja o tallo
dispone de esta capacidad, pero el tejido del interior de una yema es el que se
utiliza con más frecuencia gracias a su crecimiento activo y a su buena
respuesta en el laboratorio.
2.- PROCESO.
El proceso de “cultivo in vitro”, comprende las siguientes
fases:
1.- Esterilización
de las superficies. El material vegetal del cual se
2.- Obtención de
los explantos. Esta operación se lleva a cabo, por personal
especializado, que trabaja en condiciones de asepsia, en cámaras de flujo
laminar. Inmediatamente después, se colocan los explantos, previa
esterilización, en recipientes de cultivo, por lo general de vidrio, que
contienen substrato de agar.
Introducimos la diminuta muestra en agar (una sustancia
gelatinosa a base de algas marinas), una fuente de energía que suele ser
azúcar, un regulador del crecimiento y varias vitaminas. La mezcla
Los tubos de ensayo utilizados para cultivar las muestras de
tejido serán montados en posición inclinada, para que la superficie expuesta
sea mayor y haya más espacio para el crecimiento.
3.- Proliferación
de los explantos. Los cultivos así preparados, se mantienen en cámaras
climatizadas a 20-25 ºC y sometidos a una iluminación de 3.000-5.000 lux,
siguiendo adecuados ciclos de fotoperíodo
Normalmente cada subcultivo, dura aproximadamente un mes,
con un coeficiente de proliferación que, en su óptimo, puede alcanzar una
relación de 20-1. Dado que la multiplicación in vitro, una vez iniciada,
continúa de forma exponencial, con sólo cuatro subcultivos es posible producir
en apenas tres meses, más de tres millones de plantas.
4.- Enraizamiento
de los brotes. Los pequeños brotes son inducidos a enraizar modificando
adecuadamente el substrato.
5.- Aclimatización
y trasplante. Es la fase final del proceso, durante la cual las
plántulas enraizadas se preparan gradualmente, para el cambio de las
condiciones ambientales, de las rigurosamente controladas y uniformes del
cultivo in vitro, a las extremadamente variables del cultivo en campo.
La evolución morfogenética de los explantos, está regulada
por la composición de los substratos y, en particular, por su componente
hormonal.
Es mucho más difícil trasplantar una planta joven que ha
sido cultivada en un frasco de laboratorio al mundo exterior que trasladar una
planta del sistema de nebulización al aire libre.
El traslado debe realizarse con cuidado y en varias etapas.
Primero, las plantas son llevadas a un invernadero, donde la temperatura es
alta y la humedad roza el 100 por ciento.
Después de un determinado tiempo, las plántulas son
trasladadas a otro recinto con una temperatura y humedad un poco más bajas, o
permanecen en el mismo lugar pero cambiando las condiciones medioambientales.
Cada cambio sirve para que las planas se aclimaten de forma gradual al clima
del exterior.
En la fase de proliferación, la presencia de citoquininas en
el substrato, es esencial, para estimular la formación de los nuevos brotes, ya
Los mejores resultados se consiguen cuando, la edad de los
órganos destinados a proporcionar los explantos, se tomas de plantas en la fase
juvenil o de brotes con características juveniles.
Las principales ventajas de la micropropagación residen en
la posibilidad de:
1.- Utilizar una o pocas plantas-madres y por ello tener la
seguridad de la clonación.
2.- Obtener un gran número de plantas en un espacio
restringido y en
3.- Regular los programas de producción viverística, de una
forma totalmente desvinculada de la rigurosa periodicidad de los ciclos de
cultivo de campo.
4.- Obtener plantas exentas de virus, si se trabaja con
ciertas precauciones.
5.- El precio de estas nuevas plantas será razonable en un
futuro, gracias a la rapidez con que son producidas. Este método de
multiplicación es el más rentable, de todos los métodos que hemos descrito
hasta ahora.
La micropropagación ha encontrado hasta ahora, aplicación en
arboricultura sobre todo, para multiplicar patrones caracterizados, por una
insuficiente capacidad rizógena con las técnicas convencionales de
enraizamiento. Se está aplicando en el patrón de melocotonero y almendro
GF-677, en el ciruelo GF-43, etc.
4.-
INCONVENIENTES.
Las condiciones higiénicas del cultivo de tejidos son muy
exigentes.
A diferencia de la mayoría de métodos de reproducción, donde
únicamente hay que preocuparse de controlar la presencia de hongos nocivos en
el sustrato, en el cultivo de tejidos in
vitro tanto el aire como el agua y todos los materiales utilizados tienen
que estar absolutamente libres
La temperatura, la luz, la humedad y el tiempo también son
sometidos a un riguroso control.
Para medir los ingredientes utilizados en el cultivo, hacen
falta balanzas electrónicas supersensibles. Una fuente fiable de corriente
eléctrica es esencial para esterilizar el equipo y mantener las condiciones
atmosféricas idóneas.
Necesitamos autoclaves para esterilizar los tubos de ensayo,
y diverso material, y cámaras de flujo laminar para esterilizar el aire cuando
estamos trabajando.
Todo el equipo necesario hace que la inversión inicial
resulte caro.
El cultivo in vitro consiste en tomar una
porción de una planta (ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de
tallo, meristemo, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio
nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerará una o
muchas plantas.
Durante las últimas décadas, la técnica del
cultivo “in vitro” ha ganado especial interés para el establecimiento de
diversas plantas para la producción de compuestos o la obtención de cultivos
más sanos y con características genéticas específicas.
El cultivo in vitro de vegetales se basa en el
aislamiento de órganos,
La totipotencia es la capacidad de una célula
de generar un individuo completamente idéntico a la célula madre, la cual tiene
la misma información genética y la misma función (Kieran & Col, 1997), es
decir, indica que cualquier célula vegetal contiene una copia íntegra del
material genético de la planta a la que pertenece sin importar su función o
posición en ella, y por lo tanto tiene el potencial para regenerar una nueva
planta completa (Ferl y Paul, 2000).
El Cultivo in vitro es una forma de
reproducción asexual, la cual se puede realizar gracias al mecanismo de
división mitótico de las células
La potencialidad de una célula diferenciada
para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye
con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse
parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la
someta.
De este modo y desde la
óptica de la conservación de especies vegetales la aparición de la variación
espontánea no controlada y al azar durante el proceso del cultivo in vitro se
convierte en un fenómeno inesperado y no deseado en la mayoría de los casos.
El cultivo se incuba
bajo condiciones de luz, temperatura y humedad controladas, que junto con las
fisicoquímicas y nutricionales conducen el desarrollo del explante hacia la
formación de una masa celular amorfa denominada callo, o hacia la
diferenciación en un tejido organizado que
Los callos obtenidos
mediante este procedimiento pueden subcultivarse para su mantenimiento y
propagación o inducir su diferenciación para formar órganos (organogénesis),
embriones (embriogénesis) o pasarse a un medio de cultivo líquido para obtener
células y pequeños agregados en suspensión.
Los factores que se
deben tener presentes para obtener una respuesta adecuada del explante
incluyen: Posición de la planta donadora Edad ontogenética
(juvenilidad/madurez) de la planta Estado fisiológico de la misma.
Se deberá considerar la
especie con la que se está trabajando y los objetivos que se buscan. La
reproducción asexual de plantas por cultivo de
Se produce una desdiferenciación celular
acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células
indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz
de generar órganos o embriones somáticos (llamados así porque son estructuras
similares a un embrión pero que no se originaron por unión de gametos).
Organogénesis / embriogénesis directa.
La formulación del
medio cambia según se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), yemas y
raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales.
El éxito en la
propagación de una planta dependerá de lograr la expresión de la potencialidad
celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición
meristemática. Para lograrlo, debe inducirse primero la desdiferenciación
y luego la rediferenciación celular.
Un proceso de este
carácter sucede durante la formación de las raíces
En todo intento de
propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de
diferenciación depende del genoma de la especie, y está regulado por el balance
hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta
en cultivo.
Sin embargo, también se
sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que
imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados
reguladores del crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo
para conseguir la micropropagación de una planta.
Las principales
aplicaciones de la técnica de cultivo de células, tejidos y órganos vegetales
son en los campos de micropropagación, obtención de plantas libres de
patógenos, preservación de germoplasma, mejoramiento genético, biosíntesis de
metabolitos e investigación básica en áreas como la genética.
La clonación debe utilizarse para evitar el
empobrecimiento genético de las especies, teniendo el cuidado de introducir
nuevos clones, variedades e híbridos de manera permanente.
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