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lunes, 24 de septiembre de 2018

CULTIVO IN VITRO


1.- INTRODUCCIÓN.
         
        La micropropagación o Cultivo in vitro, es una técnica de
multiplicación, basada en la potencialidad organogenética de las células vegetales, y consiste en cultivar “in vitro”, sobre substratos apropiados, células aisladas, porciones más o menos limitadas de meristemos de yema, ápices vegetativos al comienzo de su desarrollo o pequeñísimas estaquillas herbáceas unigemas (microestaquillas).

         Normalmente, el material de partida utilizado en la micropropagación de plantas ,está constituido por porciones apicales de brotes en crecimiento activo, o bien yemas  o fragmentos de ápices meristemáticos. A estos
últimos, se recurre cuando se intenta obtener plántulas, exentas de virus, ya que los explantos conseguidos de esta forma están constituidos por células que, con mucha probabilidad, no están infectadas.

         Incluso la célula más diminuta de una planta posee el asombroso potencial de convertirse en una planta idéntica a su progenitora, si se dan las condiciones adecuadas. Cualquier célula de una raíz, hoja o tallo dispone de esta capacidad, pero el tejido del interior de una yema es el que se utiliza con más frecuencia gracias a su crecimiento activo y a su buena respuesta en el laboratorio.

         2.- PROCESO.

         El proceso de “cultivo in vitro”, comprende las siguientes fases:

         1.- Esterilización de las superficies. El material vegetal del cual se
quieren obtener los explantos, debe desinfectarse para impedir posibles contaminaciones de patógenos.

         2.- Obtención de los explantos. Esta operación se lleva a cabo, por personal especializado, que trabaja en condiciones de asepsia, en cámaras de flujo laminar. Inmediatamente después, se colocan los explantos, previa esterilización, en recipientes de cultivo, por lo general de vidrio, que contienen substrato de agar.

         Introducimos la diminuta muestra en agar (una sustancia gelatinosa a base de algas marinas), una fuente de energía que suele ser azúcar, un regulador del crecimiento y varias vitaminas. La mezcla
de cultivo varía, ya que no todas las especies vegetales responden a las mismas fórmulas.

         Los tubos de ensayo utilizados para cultivar las muestras de tejido serán montados en posición inclinada, para que la superficie expuesta sea mayor y haya más espacio para el crecimiento.

         3.- Proliferación de los explantos. Los cultivos así preparados, se mantienen en cámaras climatizadas a 20-25 ºC y sometidos a una iluminación de 3.000-5.000 lux, siguiendo adecuados ciclos de fotoperíodo
(en general de 16 horas de cada 24). En estas condiciones los explantos generan brotes adventicios o axilares que, después de unos dos meses, están dispuestos para ser subdivididos y transferidos a nuevos substratos. El trasplante se repite varias veces con el fin de obtener, mediante sucesivos cultivos, un número elevado de brotes.

         Normalmente cada subcultivo, dura aproximadamente un mes, con un coeficiente de proliferación que, en su óptimo, puede alcanzar una relación de 20-1. Dado que la multiplicación in vitro, una vez iniciada, continúa de forma exponencial, con sólo cuatro subcultivos es posible producir en apenas tres meses, más de tres millones de plantas.

         4.- Enraizamiento de los brotes. Los pequeños brotes son inducidos a enraizar modificando adecuadamente el substrato.

         5.- Aclimatización y trasplante. Es la fase final del proceso, durante la cual las plántulas enraizadas se preparan gradualmente, para el cambio de las condiciones ambientales, de las rigurosamente controladas y uniformes del cultivo in vitro, a las extremadamente variables del cultivo en campo.


         La evolución morfogenética de los explantos, está regulada por la composición de los substratos y, en particular, por su componente hormonal.
         Es mucho más difícil trasplantar una planta joven que ha sido cultivada en un frasco de laboratorio al mundo exterior que trasladar una planta del sistema de nebulización al aire libre.

         El traslado debe realizarse con cuidado y en varias etapas. Primero, las plantas son llevadas a un invernadero, donde la temperatura es alta y la humedad roza el 100 por ciento.

         Después de un determinado tiempo, las plántulas son trasladadas a otro recinto con una temperatura y humedad un poco más bajas, o permanecen en el mismo lugar pero cambiando las condiciones medioambientales. Cada cambio sirve para que las planas se aclimaten de forma gradual al clima del exterior.

         En la fase de proliferación, la presencia de citoquininas en el substrato, es esencial, para estimular la formación de los nuevos brotes, ya
que suprime la dominancia apical de los empleados como explantos. En la fase de enraizamiento, por el contrario, el substrato no contiene citoquininas, se reducen las giberelinas y se aumenta las dosis de auxinas sobre todo de IBA, para promover la diferenciación de las raíces.

         Los mejores resultados se consiguen cuando, la edad de los órganos destinados a proporcionar los explantos, se tomas de plantas en la fase juvenil o de brotes con características juveniles.

   3.- VENTAJAS.

         Las principales ventajas de la micropropagación residen en la posibilidad de:

         1.- Utilizar una o pocas plantas-madres y por ello tener la seguridad de la clonación.

         2.- Obtener un gran número de plantas en un espacio restringido y en
un tiempo limitado. Hasta un millón de plantas pueden ser cultivadas en un espacio de 6 por 7,5 metros cuadrados al año.

         3.- Regular los programas de producción viverística, de una forma totalmente desvinculada de la rigurosa periodicidad de los ciclos de cultivo de campo.

         4.- Obtener plantas exentas de virus, si se trabaja con ciertas precauciones.

         5.- El precio de estas nuevas plantas será razonable en un futuro, gracias a la rapidez con que son producidas. Este método de multiplicación es el más rentable, de todos los métodos que hemos descrito hasta ahora.

         La micropropagación ha encontrado hasta ahora, aplicación en arboricultura sobre todo, para multiplicar patrones caracterizados, por una insuficiente capacidad rizógena con las técnicas convencionales de enraizamiento. Se está aplicando en el patrón de melocotonero y almendro GF-677, en el ciruelo GF-43, etc.

         4.- INCONVENIENTES.

         Las condiciones higiénicas del cultivo de tejidos son muy exigentes.

         A diferencia de la mayoría de métodos de reproducción, donde únicamente hay que preocuparse de controlar la presencia de hongos nocivos en el sustrato, en el cultivo de tejidos in vitro tanto el aire como el agua y todos los materiales utilizados tienen que estar absolutamente libres
de levaduras, hongos y bacterias. Por lo tanto primero hay que esterilizar todos los materiales, el aire y el agua que entren dentro del área del laboratorio.

         La temperatura, la luz, la humedad y el tiempo también son sometidos a un riguroso control.

         Para medir los ingredientes utilizados en el cultivo, hacen falta balanzas electrónicas supersensibles. Una fuente fiable de corriente eléctrica es esencial para esterilizar el equipo y mantener las condiciones atmosféricas idóneas.

         Necesitamos autoclaves para esterilizar los tubos de ensayo, y diverso material, y cámaras de flujo laminar para esterilizar el aire cuando estamos trabajando.

         Todo el equipo necesario hace que la inversión inicial resulte caro.

          5.- RESUMEN.

El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerará una o muchas plantas.

Durante las últimas décadas, la técnica del cultivo “in vitro” ha ganado especial interés para el establecimiento de diversas plantas para la producción de compuestos o la obtención de cultivos más sanos y con características genéticas específicas.

El cultivo in vitro de vegetales se basa en el aislamiento de órganos,
tejidos o células vegetales y en el ajuste de las condiciones necesarias para la obtención de respuestas fisiológicas o morfogénicas a partir de es­tos explantes (Höxtermann, 1997). El cultivo de células y tejidos in vitro (CCTV) involucra diferentes técnicas a partir de diferente material vegetal tales como cloroplastos, células, tejidos, órganos e incluso plantas completas. 

La totipotencia es la capacidad de una célula de generar un individuo completamente idéntico a la célula madre, la cual tiene la misma información genética y la misma función (Kieran & Col, 1997), es decir,  indica que cualquier célula vegetal contiene una copia íntegra del material genético de la planta a la que pertenece sin importar su función o posición en ella, y por lo tanto tiene el potencial para regenerar una nueva planta completa (Ferl y Paul, 2000).

El Cultivo in vitro es una forma de reproducción asexual, la cual se puede realizar gracias al mecanismo de división mitótico de las células
vegetales. La división celular mitótica implica una replicación de los cromosomas de las células hijas, por lo que poseen un genotipo idéntico al de la célula madre.

La potencialidad de una célula diferenciada para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta.

         De este modo y desde la óptica de la conservación de especies vegetales la aparición de la variación espontánea no controlada y al azar durante el pro­ceso del cultivo in vitro se convierte en un fenómeno inesperado y no de­seado en la mayoría de los casos.

            El cultivo se incuba bajo condiciones de luz, temperatura y humedad controladas, que junto con las fisicoquímicas y nutricionales conducen el desarrollo del explante hacia la formación de una masa celular amorfa denominada callo, o hacia la diferenciación en un tejido organizado que
producirá órganos o embriones.

           Los callos obtenidos mediante este procedimiento pueden subcultivarse para su mantenimiento y propagación o inducir su diferenciación para formar órganos (organogénesis), embriones (embriogénesis) o pasarse a un medio de cultivo líquido para obtener células y pequeños agregados en suspensión.

          Los factores que se deben tener presentes para obtener una respuesta adecuada del explante incluyen: Posición de la planta donadora Edad ontogenética (juvenilidad/madurez) de la planta Estado fisiológico de la misma.

          Se deberá considerar la especie con la que se está trabajando y los objetivos que se buscan.  La reproducción asexual de plantas por cultivo de
tejidos es posible gracias a que, en general, las células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos.

           Se produce una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos (llamados así porque son estructuras similares a un embrión pero que no se originaron por unión de gametos). Organogénesis / embriogénesis directa.

             La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales.

            El éxito en la propagación de una planta dependerá de lograr la expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. Para lograrlo, debe inducirse  primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación celular.

           Un proceso de este carácter sucede durante la formación de las raíces
adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias. Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada, es la composición del medio de cultivo.

           En todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie, y está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo.

          Sin embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta.

           Las principales aplicaciones de la técnica de cultivo de células, tejidos y órganos vegetales son en los campos de micropropagación, obtención de plantas libres de patógenos, preservación de germoplasma, mejoramiento genético, biosíntesis de metabolitos e investigación básica en áreas como la genética.

            La clonación debe utilizarse para evitar el empobrecimiento genético de las especies, teniendo el cuidado de introducir nuevos clones, variedades e híbridos de manera permanente. 


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