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jueves, 3 de marzo de 2016

MICROPOPAGACIÓN DE PLANTAS

1.- INTRODUCCIÓN.
             La micropropagación, es una técnica de multiplicación, basada en
la potencialidad organogenética de las células vegetales, y consiste en cultivar “in vitro”, sobre substratos apropiados, células aisladas, porciones más o menos limitadas de meristemos de yema, ápices vegetativos al comienzo de su desarrollo o pequeñísimas estaquillas herbáceas unigemas (microestaquillas).

       Normalmente, el material de partida utilizado en la micropropagación de plantas, está constituido por porciones apicales de brotes en crecimiento activo, o bien yemas  o fragmentos de ápices meristemáticos. A estos últimos, se recurre cuando se intenta obtener plántulas, exentas de virus, ya que los explantos conseguidos de
esta forma, están constituidos por células que con mucha
probabilidad, no están infectadas.

             Incluso la célula más diminuta de una planta, posee el asombroso potencial de convertirse en una planta idéntica a su progenitora, si se dan las condiciones adecuadas. Cualquier célula de una raíz, hoja o tallo dispone de esta capacidad, pero el tejido del interior de una yema, es lo que se utiliza con más frecuencia, gracias a su crecimiento activo y a su buena respuesta en el laboratorio.

Desde hace 50 años se ha demostrado el avance en el desarrollo de la biotecnología vegetal, principalmente en la propagación de especies vegetales. Muchas veces, insisto, he pensado en la superioridad del Reino Vegetal sobre el Vegetal en algunos aspectos, y el tema que vamos a tratar es uno de ellos.

Como es capaz, un ser vivo, a partir de una célula, producir otro, con las mismas características genéticas que el anterior.

Para este propósito existe toda una tecnología biológica repartida por grandes laboratorios e invernaderos de diferentes países, que resitúa ganancias en miles de millones de dólares. A este sistema de propagación se le conoce como micropropagación, que tiene como base principal el cultivo in vitro de tejidos vegetales, una de las más importantes aplicaciones para la producción masiva de plantas de interés económico o biológico.


También se le suele denominar con el término “cultivo in vitro de tejidos”, que significa cultivar algunas partes de las plantas también llamados “explantes”, como segmentos de hoja, tallo y raíces, además de otros tejidos u órganos vegetales, dentro de un frasco de vidrio, en un ambiente artificial, en los que deben de controlarse la asepsia, el crecimiento y el desarrollo de estos diferentes tejidos. No deben de crecer microorganismos como bacterias y hongos, y los tejidos o plantas deben de mostrar un óptimo desarrollo.

             2.- PROCESO.
             El proceso de “cultivo in vitro”, comprende las siguientes fases:

             1.- Esterilización de las superficies. El material vegetal del cual se
quieren obtener los explantos, debe desinfectarse para impedir posibles contaminaciones de patógenos.

             Para lograr un cultivo “in vitro” de plantas, los tejidos y órganos (incluyendo semillas) deben ser esterilizados de manera superficial (asepsia)

             2.- Obtención de los explantos. Esta operación se lleva a cabo, por personal especializado, que trabaja en condiciones de asepsia, en cámaras de flujo laminar.

La elección del explante para iniciar un cultivo in vitro adecuado,
constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos. Se ha demostrado que la edad fisiológica del explante es un factor importante en la formación de órganos, entre más joven, más fácil será su adaptación y respuesta al cultivo in vitro.

El explante más usado para los procesos de propagación in vitro son las yemas apicales y axilares de las plantas.

Inmediatamente después, se colocan los explantos, previa esterilización, en recipientes de cultivo, por lo general de vidrio, que contienen substrato de agar.

El agar es una sustancia gelatinosa a base de algas marinas, una fuente de energía que suele ser azúcar, un regulador del crecimiento y varias vitaminas. La mezcla de cultivo varía, ya que no todas las especies vegetales responden a las mismas fórmulas.

A estos medios de cultivo se le incorporan combinaciones adecuadas de auxinas y citoquininas, dos de las principales fitohormonas del crecimiento
vegetal. Con la aplicación de éstas y el cultivo controlado como el pH, la luz y la temperatura, es posible reproducir todos los factores que puedan incidir en el crecimiento y desarrollo de los tejidos o de las plantas in vitro.

Los cultivos in vitro se mantienen en cuartos o cámaras de crecimiento con luz artificial, en una temperatura promedio de 25°C, una intensidad de 25 a 35 µmol/m2-seg con un fotoperiodo de 12 a 16 horas de luz.

Aunque de manera comercial existen diversos medios de cultivo, éstos
generalmente se componen de una mezcla de sales minerales (macro- y micro- elementos), vitaminas y sacarosa. La composición del medio depende de la especie vegetal y del tipo de cultivo que se requiere.

    Seguidamente se introducen los tejidos vegetales en tubos de ensayo, semejantes a los utilizados para cultivar las muestras de cualquier tejido, y serán montados en posición inclinada, para que la superficie expuesta sea mayor y que haya más espacio para el crecimiento.

   3.- Proliferación de los explantos. Los cultivos así preparados, se mantienen en cámaras climatizadas a 20-25 ºC y sometidas a una
iluminación de 3.000-5.000 lux, siguiendo adecuados ciclos de fotoperiodo (en general de 16 horas, de cada 24).

En estas condiciones los explantos generan brotes adventicios o axilares que, después de unos dos meses, están dispuestos para ser subdivididos y transferidos a nuevos substratos. El trasplante se repite varias
veces con el fin de obtener, mediante sucesivos cultivos, un número elevado de microestacas.

             Normalmente cada subcultivo, dura aproximadamente un mes, con un coeficiente de proliferación que, en su óptimo, puede alcanzar una relación de 20-1. Dado que la multiplicación in vitro, una vez iniciada, continúa de forma exponencial, con sólo cuatro subcultivos es posible producir en apenas tres meses, más de tres millones de plantas.

             4.- Enraizamiento de los brotes. Los pequeños brotes son inducidos a enraizar modificando adecuadamente el substrato.

             5.- Aclimatización y trasplante. Es la fase final del proceso, durante la cual las plántulas enraizadas se preparan gradualmente, para el cambio de las condiciones ambientales, de las rigurosamente controladas y
uniformes del cultivo in vitro, a las extremadamente variables del cultivo en campo.

Una vez que las plantas se han multiplicado y desarrollado in vitro, éstas deben de trasplantarse a suelo o sustrato específico de cada especie, pasando por un periodo de aclimatación, en el cual se adaptan a las condiciones de humedad de una cámara de crecimiento o del invernadero, disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz.

Las plantas primero se cultivan en contenedores cubiertos por un plástico y posteriormente son plantadas en maceta para su crecimiento y desarrollo en invernadero.

             La evolución morfogenética de los explantos, está regulada por la composición de los substratos y, en particular, por su componente hormonal.

             Es mucho más difícil trasplantar una planta joven que ha sido cultivada en un frasco de laboratorio, al mundo exterior, que trasladar una planta del sistema de nebulización al aire libre.

             El traslado debe realizarse con cuidado y en varias etapas. Primero, las plantas son llevadas a un invernadero, donde la temperatura es alta y la humedad roza el 100 por ciento.

             Después de un determinado tiempo, las plántulas son trasladadas a otro recinto con una temperatura y humedad un poco más bajas, o permanecen en el mismo lugar, pero cambiando las condiciones medioambientales. Cada cambio, sirve para que las plantas se aclimaten de forma gradual al clima del exterior.

             En la fase de proliferación, la presencia de citoquininas en el substrato, es esencial para estimular la formación de los nuevos brotes, ya que suprime la dominancia apical de los empleados como explantos. En la fase de enraizamiento, por el contrario, el substrato no contiene citoquininas, se reducen las giberelinas y se aumenta las dosis de auxinas sobre todo de IBA, para promover la diferenciación de las raíces.

             Los mejores resultados se consiguen cuando, la edad de los órganos destinados a proporcionar los explantos, se tomas de plantas en la fase juvenil o de ramas con características juveniles (hijuelos, chupones, etc.).

             3.- CÁMARAS DE FLUJO LAMINAR.
             Para el crecimiento y enraizamiento de los explantos, se utilizan
unas cámaras con un flujo laminar de calor, para que el medio esté aséptico y podamos operar sobre el con nuestros tejidos, Dentro de las aplicaciones científicas, farmacéuticas y clínicas es indispensable contar con estos espacios que están libres de bacterias o microorganismos, y que no puedan contaminar el espacio de trabajo.

Dentro de la cámara existen unas campanas de flujo laminar, que son aquellas herramientas que nos permiten realmente obtener una zona estéril y segura, para cualquier necesidad que se requiera dentro de un laboratorio.

         4.- VENTAJAS.
Las principales ventajas de la micropropagación residen en la posibilidad de:
Utilizar una o pocas plantas-madres y por ello tener la seguridad de la
clonación. Las plantas obtenidas por este sistema son réplicas exactas entre sí y fieles copias de la planta progenitora.

  1. Obtener un gran número de plantas en un espacio restringido y en un tiempo limitado. Hasta un millón de plantas pueden ser cultivadas en un espacio de 6 por 7,5 metros cuadrados al año.

  2. La micropropagación es un sistema de propagación asexual, a partir de un segmento de una planta madre, que da como resultado la propagación masiva de plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. En algunas ocasiones es posible acortar los tiempos de producción de plantas.

  3. El número de individuos obtenidos por este método es muy superior al obtenido por cualquier otro método de propagación, por unidad de

    propágulo.

  4. Con esta biotécnica se incrementa de forma exponencial el número de plantas en microexplantes menores a 1 cm de longitud o de diámetro, en los que se forman minúsculos brotes que se desarrollan hasta la formación de plantas, mediante el fenómeno de la regeneración vegetal.


  • Lo anterior se explica debido a que las células vegetales son capaces de generar una planta a partir de una simple célula, proceso conocido como “totipotencialidad”.

  • Regular los programas de producción viverística, de una forma totalmente desvinculada de la rigurosa periodicidad de los ciclos de cultivo de campo.

  • Facilita el almacenaje y transporte de plantas reales o potenciales.

  •  Obtener plantas exentas de virus, si se trabaja con ciertas precauciones.

  • Permite la obtención de plantas de alto registro fitosanitario, ya que al someter al tejido vegetal a este sistema de cultivo se eliminan totalmente las enfermedades de tipo bacteriano y fúngico y en algunas ocasiones las de tipo viral.
  • Ø       El precio de estas nuevas plantas será razonable en un futuro, gracias a la rapidez con que son producidas. Este método de multiplicación es el más rentable de todos, pero requiere también unas instalaciones más sofisticadas.
  • Ø   
    Los callos son un grupo de células con alta división celular que han perdido el control de la diferenciación, que crecen de modo continuo en forma de cúmulos celulares, a partir de los cuales pueden formarse brotes o embriones somáticos.
  • Ø    Elimina los problemas de largas cuarentenas a que son sometidas las plantas en las fronteras cuando se trata de introducirlas de un país a otro.

  • Para la generación de las plantas, los brotes deben de ser inducidos a producir raíces y los embriones somáticos a germinar. Estos últimos se desarrollan de forma similar a un embrión cigótico (dentro de la
    semilla) a diferencia que los embriones somáticos provienen de células de tejidos vegetativos y no por la interacción de las células sexuales, como es el caso para los embriones cigóticos.
 Estos procesos de regeneración se obtienen por la adición de las auxinas y citocininas (reguladores de crecimiento vegetal), que dependiendo de la concentración y combinación de ambas, será la respuesta regenerativa.
  •    La micropropagación ha encontrado, hasta ahora, aplicación en Fruticultura sobre todo, para multiplicar patrones caracterizados, por una insuficiente capacidad rizógena con las técnicas convencionales de enraizamiento. Se está aplicando en el patrón de melocotonero y almendro GF-677, en el ciruelo GF-43, etc.

             5.- INCONVENIENTES.
             Las condiciones higiénicas del cultivo de tejidos son muy exigentes.
          
        A diferencia de la mayoría de métodos de reproducción, donde
únicamente hay que preocuparse de controlar la presencia de hongos nocivos en el sustrato, en el cultivo de tejidos in vitro tanto el aire como el agua y todos los materiales utilizados tienen que estar absolutamente libres de levaduras, hongos y bacterias. Por lo tanto primero hay que esterilizar todos los materiales, el aire y el agua que entren dentro del área del laboratorio.

             La temperatura, la luz, la humedad y el tiempo también son sometidos a un riguroso control.

             Para medir los ingredientes utilizados en el cultivo, hacen falta balanzas electrónicas suprasensibles. Una fuente fiable de corriente eléctrica es esencial para esterilizar el equipo y mantener las condiciones atmosféricas idóneas.

             Necesitamos autoclaves para esterilizar los tubos de ensayo, y
diverso material, y cámaras de flujo laminar para esterilizar el aire cuando estamos trabajando.

             Todo el equipo necesario hace que la inversión inicial resulte caro.

La formación de plantas en tejidos vegetativos como los tallos y las hojas, puede llevarse a cabo por dos diferentes maneras, en tejidos sin diferenciación celular (callos) y de forma directa en los explantes cultivados, regenerando plantas mediante la formación de brotes (organogénesis) o de embriones somáticos (embriogénesis somática).

El número de plantas que se regenere en un explante y el tiempo de cultivo, dependen de la especie vegetal, en plantas herbáceas pueden producirse un gran número de plántulas por explante en no más de 60 días de cultivo, pero en plantas leñosas o arbóreas solamente unas cuantas y puede lograrse hasta los 180 días. Al cultivarse segmentos de 1 cm2 de hoja de Violeta africana (Saintpaulia), pueden producirse hasta 50 plántulas en 60 días de cultivo; en yemas de aguacate solo se regeneran de 3 a 5 brotes, formando plántulas hasta los 120 días del cultivo.

Debido a lo sofisticado de la técnica, la micropropagación es restringida y aplicada solo en laboratorios de investigación o en grandes empresas que cuentan con recursos para el mantenimiento del proceso y hacerlo costeable económicamente, lo cual es un hecho debido a la gran cantidad de plantas que por esta vía se obtienen.

Es justificable el método solo en plantas con reproducción natural difícil, plantas en peligro de extinción, plantas con características importantes únicas como las transgénicas y plantas de uso ornamental con valor unitario elevado.

Recientemente se han establecido sistemas de micropropagación
utilizando medios de cultivo líquidos con el objetivo de automatizar la propagación de plantas, aumentar el número de éstas por explante y por lo tanto disminuir los costos de producción.

Esto se ha logrado con el diseño de biorreactores, en especial los llamados biorreactores de inmersión temporal, un método exitoso para la propagación masiva de diversas plantas que, es muy utilizado por los grandes laboratorios de biotecnología.

En los últimos años se estima que se cultivan unas 800 millones de hectáreas con plantas micropropagadas, producidas por más de 50 laboratorios en Latinoamérica y más de 1.000 alrededor del mundo, donde se propagan miles de millones de plantas por año.

Las plantas propagadas por esta técnica que mayormente se comercializan son fresa, patata, patata, plátano, caña de azúcar,  bambú, orquídeas y algunas cactáceas. América Latina y los Países Bajos son México, son los países con mayor número de laboratorios.

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